激光共焦

A. 激光掃描共焦顯微鏡技術的名詞解釋

激光共聚焦掃描顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。

B. 為什麼激光共聚焦顯微鏡拍出來的是灰度圖

真實色共焦顯微鏡與激光掃描共焦顯微鏡，二者在成像原理上基本是一樣的，最大不同之處是照明光源不同。1、激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡的照明光源是激光，即單色光。其實際成像過程是根據被觀察物體對該單色激光的反射光的強弱來成像的。由於是單色光照明，不能分辨顏色，對於在同一試樣的同一視場內，顏色不同，但對該單色激光反射光強度相同的不同組織或成分不能分辨。容易產生同相異色，同色異相的現象，不利於對微觀組織和成分的正確分辨。2、真實色共焦顯微鏡真實色共焦顯微鏡的光源是氙光源，即白光。其實際成像過程是在白光照明的條件下，對物體形貌（包括顏色）進行綜合的成像。由於是多色光照明和成像，真實色共焦顯微鏡能夠更真實的反應物體的顏色和形貌，避免了激光掃描共焦顯微鏡產生的同相異色，同色異相的現象發生，觀察者可以通過顏色，分辨和判斷試樣的成分和組織。在這方面，其解析度遠強於激光掃描共焦顯微鏡綜合分析：在有顏色差異的試樣的觀察條件下，真實色共焦顯微鏡避免了激光掃描共焦顯微鏡產生的同相異色，同色異相的現象發生，觀察者可以通過顏色，分辨和判斷試樣的成分和組織。在這種條件下，真實色共焦顯微鏡的解析度高於激光掃描共焦顯微鏡。在單色試樣的觀察條件下，解析度才接近各自的技術指標。然而，在實際觀察的試樣中，絕大多數不同的組織和成分都是有顏色差異的。對應於沒有顏色差異或顏色差異小的試樣，可以通過人為的染色（例如腐蝕處理），提高圖像的分辨能力。在這一方面，激光掃描共焦顯微鏡是無能為力的。另外，解析度是在特定條件下所能達到的一項技術指標，當在實際使用中，不滿足該技術條件時（實際是常常不能滿足），其解析度是達不到所給出的數值。下圖是鎳鉻合金在普通單色激光共聚焦顯微鏡中的成像，以及使用真實色共聚焦顯微鏡所成圖像的對比，其中紅圈內是不同的化合物摻雜，可以清楚看到用單色激光共聚焦顯微鏡所成的圖像，僅憑灰度是無法准確反應其中化合物摻雜的區別的，而真實色共聚焦卻可以清楚區分他們的不同。

C. 什麼是共焦激光掃描顯微鏡

由德國卡爾·蔡司公司生產的這種顯微鏡，把激光光束聚焦到生物回樣品的某個平面答，而把該面前後的離焦光束擋掉。這種被稱作「光學截面制圖」的技術，可以將不同聚焦程度的圖像重迭，焦深很大。系統解析度達0.2微米。尤其是它的三維成像能力，使研究人員可以在原生物樣品中「旅遊」，或確定吸收熒光染色的細胞組織位置。因此可顯示活細胞的相互作用，以及DNA或神經網路等細胞物體的三維結構。在對染色體進行分析時，研究人員可在一個正在分裂的細胞掃描場中觀察到轉變期的整個過程，然後可變焦到某一個染色體，尋找可能的缺陷和斷裂。由於許多樣品都很嬌嫩，不能承受高能激光，所以要求熒光探測用的光電倍增管具有高靈敏度，以免熒光衰退。

D. 共焦激光掃描顯微鏡可以用於哪些領域

由德國卡爾·蔡司公司生產的這種顯微鏡，把激光光束聚焦到生物樣品的某個平面，而把該面前後的離焦光束擋掉。這種被稱作「光學截面制圖」的技術，可以將不同聚焦程度的圖像重迭，焦深很大。系統解析度達0.2微米。尤其是它的三維成像能力，使研究人員可以在原生物樣品中「旅遊」，或確定吸收熒光染色的細胞組織位置。因此可顯示活細胞的相互作用，以及DNA或神經網路等細胞物體的三維結構。在對染色體進行分析時，研究人員可在一個正在分裂的細胞掃描場中觀察到轉變期的整個過程，然後可變焦到某一個染色體，尋找可能的缺陷和斷裂。由於許多樣品都很嬌嫩，不能承受高能激光，所以要求熒光探測用的光電倍增管具有高靈敏度，以免熒光衰退。

這種共焦激光顯微鏡正用於神經學、遺傳學、免疫學、病理學、生物生理學。當然也可以用於工業領域。如陶瓷和金屬超精細加工，可用這種顯微鏡探測到材料表面0.1微米量級的微小高度起伏。

E. 激光共聚焦掃描顯微鏡又叫共焦激光掃描顯微鏡嗎

正確叫法是激光共聚主要焦掃描顯微鏡，意思是使用一束激光，通過物鏡聚焦在樣品上（第一次聚焦），焦斑被樣品微小區域散射，這時的背散射光，再次通過同一個物鏡反向聚焦在探測器上，作為這一像素的成像信號保存。
共焦激光掃描顯微鏡，是有些人記憶差錯，順嘴啦啦出的一個概念，說明他/她不是真正了解激光共聚焦掃描顯微鏡原理。

F. 激光共聚焦顯微鏡與真實色共聚焦顯微鏡的區別

真實色共焦顯微鏡與激光掃描共焦顯微鏡，二者在成像原理上基本是一樣的，最大不同之處是照明光源不同。

1、激光掃描共焦顯微鏡

激光掃描共焦顯微鏡的照明光源是激光，即單色光。其實際成像過程是根據被觀察物體對該單色激光的反射光的強弱來成像的。

由於是單色光照明，不能分辨顏色，對於在同一試樣的同一視場內，顏色不同，但對該單色激光反射光強度相同的不同組織或成分不能分辨。容易產生同相異色，同色異相的現象，不利於對微觀組織和成分的正確分辨。

2、真實色共焦顯微鏡

真實色共焦顯微鏡的光源是氙光源，即白光。其實際成像過程是在白光照明的條件下，對物體形貌（包括顏色）進行綜合的成像。

由於是多色光照明和成像，真實色共焦顯微鏡能夠更真實的反應物體的顏色和形貌，避免了激光掃描共焦顯微鏡產生的同相異色，同色異相的現象發生，觀察者可以通過顏色，分辨和判斷試樣的成分和組織。在這方面，其解析度遠強於激光掃描共焦顯微鏡

綜合分析：在有顏色差異的試樣的觀察條件下，真實色共焦顯微鏡避免了激光掃描共焦顯微鏡產生的同相異色，同色異相的現象發生，觀察者可以通過顏色，分辨和判斷試樣的成分和組織。在這種條件下，真實色共焦顯微鏡的解析度高於激光掃描共焦顯微鏡。在單色試樣的觀察條件下，解析度才接近各自的技術指標。然而，在實際觀察的試樣中，絕大多數不同的組織和成分都是有顏色差異的。對應於沒有顏色差異或顏色差異小的試樣，可以通過人為的染色（例如腐蝕處理），提高圖像的分辨能力。在這一方面，激光掃描共焦顯微鏡是無能為力的。

另外，解析度是在特定條件下所能達到的一項技術指標，當在實際使用中，不滿足該技術條件時（實際是常常不能滿足），其解析度是達不到所給出的數值。

下圖是鎳鉻合金在普通單色激光共聚焦顯微鏡中的成像，以及使用真實色共聚焦顯微鏡所成圖像的對比，其中紅圈內是不同的化合物摻雜，可以清楚看到用單色激光共聚焦顯微鏡所成的圖像，僅憑灰度是無法准確反應其中化合物摻雜的區別的，而真實色共聚焦卻可以清楚區分他們的不同。

G. 簡述激光共焦掃描顯微鏡與普通光學顯微鏡成像方式的區別和優缺點

一、普通生物顯微鏡由3部分構成，即：①照明系統，包括光源和聚光器；②光學放大系統，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復雜的透鏡組構成；③機械裝置，用於固定材料和觀察方便。優點：操作簡便，制樣方便。
二、激光共聚焦掃描顯微鏡，用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由於激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的連續圖像，這些圖像信息都儲於計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構，實現三維成像與解析，獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統的三維圖像。優點：解析度高於普通光學顯微鏡；能對樣品進行連續無損光學切片，並去除了雜散光的影響，增加了圖像的清晰度。

H. 光譜共焦感測器與普通激光位移感測器有什麼區別

光譜共焦的精度比普通激光位移感測器的精度要高很多，光譜共焦的基本是納米級的精度，而普通激光的最高也是微米級的。光譜共焦的量程卻遠遠小於普通激光位移感測器。

I. 熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區別

一、原理不同

1、熒光顯微鏡：是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體， 使之發出熒光， 然後在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。

2、激光共聚焦顯微鏡：在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發熒光探針。

二、特點不同

1、熒光顯微鏡：用於研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。 細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射後可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色後，經紫外線照射亦可發熒光。

2、激光共聚焦顯微鏡：利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。

三、用處不同

1、熒光顯微鏡：熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板系統和光學系統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射熒光，通過物鏡和目鏡系統放大以觀察標本的熒光圖像。

2、激光共聚焦顯微鏡：激光掃描共聚焦顯微技術已用於細胞形態定位、立體結構重組、動態變化過程等研究，並提供定量熒光測定、定量圖像分析等實用研究手段，結合其他相關生物技術，在形態學、生理學、免疫學、遺傳學等分子細胞生物學領域 得到廣泛應用。

J. 激光共焦拉曼光譜的原理是什麼

激光共焦拉曼光譜是用來分析物質組分﹑結構等的一種有效光譜分析手段，其原理是入射激光會引起分子（或晶格）產生振動而損失（或獲得）部分能量，致使散射光頻率發生變化對散射光的分析，即拉曼光譜分析，可以探知分子的組分，結構及相對含量等，因此被廣泛成為分子探針技術。該儀器是在1960後產生的，他的光源採用激光，這樣增加了拉曼信號的強度，增強了信號的的強度，使拉曼光譜擴大了適用范圍。目前拉曼光譜已成為現代材料結構分析的基本技術手段。