預測真菌學

⑴ 如何研究一個預測基因的功能

自上個世紀90年代中期全基因組測序技術出現後，一種新技術方法也隨著迅猛發展，這種稱為基於約束的通量分析的方法通過一系列針對基於約束的構建和模擬用途而編寫的函數進行模擬運算。

近幾年COBRA已經被用於預測細胞的功能，比如預測不同基質條件下細胞生長的能力，以及基因敲除在全基因組范圍內的影響。不少科學家們希望能了解並應用這種方法，尤其是在代謝工程，抗生素設計和酶研究方面。

全基因組范圍的代謝網路在基因組序列的基礎上，結合基因功能注釋信息，把基因編碼蛋白所催化的生化反應構建為一個代謝網路，反應了基因-蛋白質-生化反應之間的相互作用，從而有效地轉化為數學模型在計算機上進行模擬、分析，並用實驗數據加以驗證，提出假設。

這種網路能從全局的角度探索和揭示生物代謝機制提供一個有效的框架，很好地將基因型與表型的關系定量地關聯起來。目前科學家們已經構建了包括真菌、古生菌和真核生物在內的多種代謝網路。

而要進行這種構建，COBRA是一種重要的方法，這種方法是由一系列針對基於約束的構建和模擬用途而編寫的函數組成，含有可以讀取SBML或Excel格式的模型的函數，使用者不再需要自己編寫提取矩陣的程序。

在基因組規模上對細胞網路進行重建，可以建立預測性的代謝模型，不過一般這樣的研究都沒有包括蛋白的結構信息。研究人員在建模過程中，添加了蛋白的結構數據，實現了對蛋白熱穩定性的系統性研究。該模型可以預測在非最佳溫度下限制整個系統功能的蛋白，還可以確定能增強細胞耐熱能力的突變。在此基礎上，人們將有望構建更耐熱的微生物菌株用於工業生產，例如生產常用化學物質或治療性蛋白等。

研究人員模擬了來自人類病原菌支原體整個生命周期，提出了一個全細胞計算機模型，這一模型囊括了這個病原菌的所有分子組，以及相互作用，這將有助於促進細胞生物學的發展

⑵ 里氏木霉（T.reesei）的基因組

T.reesei是工業上纖維素酶和半纖維素酶的主要生產來源，這些酶用於將生物質解聚成簡單的糖類，再轉化成化學中間體和生物燃料例如乙醇。對T.reesei的基因組進行測序（Martinez et al.，2008），將reads組裝成89個scaffold，大小為34Mbp，包含9219個基因。出乎意料的是，相比其他已測序的能降解植物細胞壁多糖的真菌，T.reesei基因組中編碼的纖維素酶和半纖維素酶基因數目較少。許多T.reesei的碳水化合物活性酶編碼基因並非隨機分布，而是成簇地分布在與其他糞殼菌綱（Sardariomycetes）真菌的共線性區域之間。

7.2.1.1 T.reesei基因組的特點

利用鳥槍法對T.reesei的基因組進行測序，構建了3個文庫，插入片段的大小分別為3kb，8kb和40kb，覆蓋度為9倍，共得到 433863個 reads，利用 Jazz，Phred/Phrap/Consed等軟體將這些數據組裝成89個scaffold和97個contig，大小約為34Mb（Martinez et al.，2008）。比幾個核型分析預測的基因組大小約大2.9%（Carter et al.，1992；Man-tyla et al.，1992；Herrera-Estrella et al.，1993），與物理方法預測的大小幾乎一致。核型分析所用的遺傳標記和在Genbank中發布的所有蛋白和RNA序列在該基因組中都能找到。因此，推測該基因組序列代表了T.reesei 99%以上的基因組信息。

在基因組中發現了類似於I和II型轉座子的重復序列，但都存在多個終止密碼子。造成缺少活躍轉座子的原因可能是由於T.reesei存在活躍的防禦機制，例如重復誘導的點突變。這些轉座子總數不超過基因組序列的1%，是目前已知的出現頻率最低的真菌之一。在T.reesei的7個scaffold末端存在重復6核苷酸序列TTAGGG，該序列與粉紅麵包霉（Neurospora crassa）端粒重復序列相同。

預測T.reesei 基因組含有9129個基因，與N.crassa中的基因數目相當（Galagan et al.，2003），但是比禾穀鐮刀菌（Fusarium graminearum，其有性態為Gibberella zeae）預測的基因數少了接近2500個（Cuomo et al.，2007）。T.reesei基因的平均大小為1793 bp，每個基因平均含有3.1個外顯子，外顯子的平均長度508 bp，內含子平均大小120 bp。

7.2.1.2 T.reesei保守共線性

為了解環境因素對基因組進化的影響，比較了T.reesei，F.graminearum和N.crassa共線性的區域。根據比較結果，推測許多基因組片段中基因的順序在該種類出現時就已經改變，共線性的區段間存在很大的間隙（Galagan et al.，2005）。在很多情況下，T.reesei和其他糞殼菌綱（Sordariomycetes）真菌中這種間隙是很保守的。非共線性的區域通常包含對菌株適應性重要的基因（Galagan et al.，2005；Machida et al.，2005；Nierman et al.，2005）。另外一個值得注意的特點是在3個真菌（T.reesei，F.graminearum和N.crassa）中存在一些隨種類出現就已發生的染色體重排，表明了基因組的高度動態性。

7.2.1.3 T.reesei的蛋白結構域

與盤菌亞門（Pezizomycotina）的其他真菌相比，T.reesei基因組中已知功能的蛋白質數量較少，與生物質降解有關的蛋白組成也不一樣。T.reesei缺少與侵染和降解植物活體組織相關的蛋白，例如果膠裂解酶和果膠酯酶，這與其腐生習性相符。而且，在T.reesei中沒有發現鞣酸酶和阿魏酸酯酶，表明其在半纖維素降解方面存在缺陷。

7.2.1.4 T.reesei和其他真菌中的碳水化合物活性酶

在CAZy資料庫中，碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes，CAZymes）被分為不同的級別和種類。能切割、構建和重排寡糖和多糖的CAZymes在真菌生物學中扮演重要的角色，對優化生物質的降解也同樣重要。盡管T.reesei是植物多糖的有效降解者和降解研究體系中的重要模式菌，但是在其基因組中含有的糖苷水解酶（GH）編碼基因較少。T.reesei中僅含有200個GH編碼基因，比植物病原菌Magnaporthe grisea（231個）和F.graminearum（243個）都少。

T.reesei中含有103個糖基轉移酶，接近糞殼菌綱（Sordariomycetes）中該類酶的平均數（96個）。在糞殼菌綱中，該酶類的變異性比GH小。這種趨勢在世系內外皆存在，表明糖基轉移酶控制的是比較基礎性的胞內生命活動，其組成變化所反映的是物種的差異而非環境壓力的不同。與植物多糖解聚過程有關的酶，通常攜帶一個碳水化合物結合組件（Carbohydrate-Binding Mole，CBM），該組件連接在催化區上。在已知的糞殼菌綱中，T.reesei的基因組中含CBM的蛋白數量最少。同樣，T.reesei中碳水化合物酯酶的數量也是糞殼菌綱中最少的。包括T.reesei在內，糞殼菌綱真菌中相對缺少多糖裂解酶基因，而散囊菌綱真菌（Eurotiomycetes）含有的多糖裂解酶數量較多，平均有18個。在單細胞子囊菌綱（Ascomycetes）中沒有發現多糖裂解酶。

出人意料的是，在T.reesei基因組中僅發現了7個編碼已知纖維素酶（內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶）的基因，在表7.4列出的能降解植物細胞壁的真菌中，T.reesei的纖維素酶基因的數量最少。如果加上GH61蛋白家族，這種趨勢更加明顯。半纖維素包含不同種類的多糖，完全降解它們需要一系列的酶。T.reesei基因組僅含有16個半纖維素酶基因，也是在真菌中數量較少的。同樣，其分解果膠的酶數量為5個，也是在植物細胞壁降解真菌中數量較少的（Martinez et al.，2008）。

表7.4 真菌基因組中的纖維素水解酶

註：^a纖維素種類：CBH1，外切纖維二糖水解酶Ⅰ，GH7；CBH2，外切纖維二糖水解酶Ⅱ，GH6；EG1，內切葡聚糖酶Ⅰ，GH7；EG2，內切葡聚糖酶Ⅱ，GH5_5；EG3，內切葡聚糖酶Ⅲ，GH12_1；EG4，糖苷水解酶家族，Cel61，GH61；EG5，內切葡聚糖酶基因Ⅴ，Cel45。

7.2.1.5 蛋白分泌

T.reesei能非常有效地分泌胞外酶，有些工業菌株1L培養液可以產生100g胞外蛋白（Cherry et al.，2003）。在T.reesei中發現了與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌途徑中起作用蛋白的同源蛋白。這些蛋白多數是單拷貝，與酵母蛋白的相似性比與哺乳動物源相似蛋白的相似性更高。T.reesei含有三個與酵母的蛋白質二硫鍵異構酶（Pdi lp）同源的蛋白，這可能與T.reesei分泌的纖維素酶多數含有二硫鍵有關（Divne et al.，1994）。酵母der1和ufd1基因在T.reesei中都存在兩個直系同源基因，它們與內質網相關的蛋白降解（ERAD）途徑有關。此外，在T.reesei中發現了大多數已知ERAD組分的同源蛋白，但在Aspergillus niger基因組中卻缺少ERAD組分同源蛋白（Pel et al.，2007）。這些數據表明，在T.reesei中，ERAD途徑似乎比內質網分泌途徑更過剩。

S.cerevisiae中參與蛋白運轉相關的蛋白直系同源物大多數能在T.reesei中找到，它們多數是單拷貝。酵母缺少與哺乳動物GTPase蛋白Rab2，Rab4，Rab5，Arf6和Arf10對應的蛋白，這些信號蛋白參與膜融合或囊泡的出芽，而在T.reesei和N.crassa中含有這些蛋白的直系同源物。酵母中質膜分泌小泡受體t-SNARE蛋白Sso1p，在T.reesei中有兩個同源蛋白，研究表明，這兩個Sso1同源蛋白具有不同的功能（Valkonen et al.，2007）。綜上所述，這些研究表明T.reesei的膜運輸系統比在S.cerevisiae中的更加多樣化。

7.2.1.6 T.reesei的CAZyme基因簇

T.reesei中許多CAZyme的編碼基因在基因組中不是隨機分布的。有研究表明，9個與纖維素和半纖維素降解有關的蛋白編碼基因共同分布在基因組的幾個區域。通過對T.reesei基因組中所有CAZyme的編碼基因定位發現，316個CAZyme中的130（41%）分布在25個不連續的區域，這些區域大小從14 kb到275 kb不等（總共約2.4Mb，約占基因組的7%）。這些區域中含有CAZyme基因的密度比隨機分布基因密度大5倍。

通過對基因簇中基因數量的分析，130個CAZyme的95個（73%）分布在基因組共線性區域的間隙。而這95個中的69個（72%）在F.graminearum含有直系同源物。有16個CAZyme與F.graminearum共線性，表明基因遷移是這些基因簇形成的主要因素，而基因復制的作用較小。在同一基因簇中的CAZyme基因很少是出自同一個CAZyme家族，這也表明基因的遷移在這些基因簇形成過程的作用比基因復制更大。

CAZyme基因成簇分布表明其特殊的生物學功能，在基因簇中的CAZyme基因有70%編碼GH。基因組中有24%的糖基轉移酶基因和46%的GH基因分布在這些基因簇內，表明這些基因簇中的CAZyme基因大多數參與多糖的降解。與植物細胞壁降解有關的基因多數分布在富含CAZyme的區域的現象，也證實了這一點。T.reesei中有4個類似於擴展蛋白的基因（Saloheimo et al.，2002），其中3個分布在這些基因簇內。有趣的是，少量與真菌細胞壁合成有關的糖基轉移酶編碼基因也出現在CAZyme基因簇中，比如甘露糖基轉移酶、幾丁質合酶、a-糖基轉移酶和β-糖基轉移酶（Cabib et al.，2001）。

結合對槐二糖和纖維素誘導的T.reesei轉錄組數據進行分析（Foreman et al.，2003），將槐二糖和纖維素誘導表達基因定位到基因組上，發現盡管不是所有成簇分布的GH基因都共表達，但是確實發現了一些相鄰基因共表達的例子。例如，在T.reesei基因組第29條scaffold的CAZyme基因簇區，外切纖維二糖水解酶cel7a、纖維素膨脹因子和木聚糖酶4在槐二糖和纖維素誘導下同時表達。上述結果表明，CAZyme基因成簇分布具有重要的意義。由於這些區域與其他真菌沒有共線性的信號，表明在T.reesei中這些基因發生了重排，這種重排對其在進化上是有利的。

在幾個CAZyme基因密度高的區域也包含與次級代謝有關的蛋白編碼基因。在25個CAZyme基因簇中，有5個基因簇都包含一個聚酮合酶（PKS）或非核糖體肽合成酶（NRPS）基因。另外，與其他Sordariomycetes真菌相比，T.reesei中保留了大多數非核糖體肽合成酶（NRPS）的旁系同源基因。

⑶ 為什麼預測的tRNA上會有內含子結構

社會有內含子結構的，因為也是他一面還有這個結構，所以的話它預測上面會有這個結構。

⑷ 在學習了細菌和真菌的知識後，某實驗小組的同學對洗手前後細菌和真菌數量變化情況產生了濃厚的興趣．以下

⑸ 已知一段真菌序列，如何預測內含子

一般而言，我們根據RNA剪接位點（內含子/外顯子）來預測內含子和外顯子區間。該生物信息學推斷是基於剪接的保守性序列「GU－AG」規則，即內含子5』端序列一般是GU，而3』端一般是AG，當然它們附近的序列也是有一定規律的，但不是很保守。根據這一特點並結合ORF, Blast等數據就可以對未知基因的成熟mRNA序列進行預測。
經典的內含子預測網站有Augustus，SplicePort，GeneSplicer，NetGene2，MaxEntScan。但考慮到你是真菌序列，所有隻能選擇前兩個網站進行運算。

⑹ 選擇真菌的實驗思路

蘿卜暖男認為，
1、明確實驗目的；弄清實驗要求；
2、明確實驗原理和實驗對象內；
3、三大變數的分析容和測控方法的確定；
4、精心策劃實驗方法；
5、確定實驗順序、細節設計要合理規范；
6、正確預測實驗結果，分析並得出相應的結論；
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⑺ 求助 已知真菌基因組DNA序列如何預測cDNA序列

以mRNA為模板，經反轉錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補，稱為互補DNA或cDNA。提取出組織細胞的全部mRNA，在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體常用噬菌體或質粒載體連接後轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，並能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫，基因組含有的基因在特定的組織細胞中只有一部分表達，而且處在不同環境條件、不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細胞特異性。cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細胞特異表達的基因。但對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA。

⑻ 探究實驗．探究背景：研究細菌和真菌的分布，我們可能會有多疑問：不同環境中都有細菌和真菌嗎哪些環境

（1）根據材料提出問題，洗手前後，手上的細菌和真菌一樣多嗎？
（2）作出假設：洗手可以減少手上的細菌和真菌的數量．
（4）將手上的細菌和真菌在培養基上接種．培養細菌真菌的一般方法：①配製含有營養物質的培養基，將配製好的培養基高溫滅菌後冷卻； ②接種（將少量細菌或真菌放在培養基上的過程叫接種）；③恆溫培養；④觀察．
①在科學實驗中，往往只選擇一個變數．為研究變數對研究對象的影響，需要設計對照實驗，這樣可以增強實驗結論的說服力．在對照實驗中，除了已選擇的實驗變數不同外，其他條件應完全相同．在上述實驗中，甲同學沒有設計對照實驗，而乙同學設計了對照實驗，更具有說服力．配製好3分培養基，貼好標簽③號的作用是形成對照．
③經高溫處理的培養基，如果立即接種細菌或真菌，就會把接種的細菌或真菌殺死；因此，要將經高溫處理的培養基冷卻後再進行後面的操作．
⑤根據生活常識可預測實驗結果：會發現①③培養皿中形成的菌落多．②培養皿中形成的菌落少．所以要養成飯前便後洗手的好習慣．
故答案為：（1）洗手前後，手上的細菌和真菌一樣多嗎？
（2）洗手可以減少手上的細菌和真菌的數量；
（4）對照；防止溫度太高將接種的細菌或真菌殺死；①③培養皿中形成的菌落多．②培養皿中形成的菌落少